细胞色素C活力测定法

来源：1399全球医药网  发布日期：2016-11-02  发布者：taoyn  共阅614次  字体：大 中 小

B. 细胞色素C活力测定法
　　试剂
　　(1) 磷酸盐缓冲液(0.2mol/L)
　　取磷酸氢二钠71.64g,加水使溶解成1000ml,作为甲液。另取磷酸二氢钠27.60g，加水使溶解成1000ml，作为乙液。取甲液81ml与乙液19ml，混匀，调节pH值至7.3。
　　(2) 磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)
　　取磷酸盐缓冲液(0.2mol/L)500ml,加水稀释成1000ml，调节pH值至7.3。
　　(3) 磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)
　　取磷酸盐缓冲液 (0.2mol/L) 100ml，加水稀释成1000ml，调节pH值至7.3。
　　(4) 琥珀酸盐溶液
　　取琥珀酸与氢氧化钾各4.72g，加水使溶解成100ml，调节pH值至7.3。
　　(5) 氰化钾溶液 取氰化钾0.65g,加水使溶解成100ml后,用稀硫酸调节pH值至7.3。
　　(6) 去细胞色素C的心悬浮液
　　取新鲜猪(牛)心2只，除去脂肪与结缔组织,切成条,用绞肉机绞碎，置纱布兜中，用常水冲洗约2小时(经常搅动，挤出血色素)，挤干,用水洗数次，挤干，置磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)中浸泡约1小时，挤干，重复浸泡1次，用水洗数次,挤干，置组织捣碎机内，加磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)适量恰使猪(牛)心浸没，捣成匀浆，离心10分钟(普通离心机)，取上层混悬液，加冰块少量，迅速用稀醋酸调节pH值至约5.5，立即离心15分钟，取沉淀，加等体积的磷酸盐缓冲液(0.1mol/L),用玻璃匀浆器磨匀后,贮存于冰箱中；临用时取1.0ml,加磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)稀释成10ml.
　　供试品溶液的制备
　　取供试品，加水制成每1ml中含细胞色素C约3mg的溶液。
　　测定法
　　取磷酸盐缓冲液(0.2mol/L)5ml、 琥珀酸盐溶液1.0ml与供试品溶液0.5ml（如系还原型制剂，应加入0.01mol/L铁氰化钾溶液0.05ml），置25ml具塞比色管中,加去细胞色素C的心悬浮液0.5ml与氰化钾溶液1.0ml，加水稀释至10ml，摇匀,以同样的试剂作空白，照分光光度法（附录Ⅳ A），在550nm的波长处附近，间隔0.5nm找出最大吸收波长，并测定吸收度，直至吸收度不再增大为止，作为酶还原吸收度；然后各加连二亚硫酸钠约5mg，摇匀,放置约10分钟，在上述同一波长处测定吸收度，直至吸收度不再增大为止，作为化学还原吸收度；按下式计算。
　　　　　　　　　　　　酶还原吸收度
　　细胞色素C活力＝───────────×100％
　　　　　　　　　　　化学还原吸收度

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